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SPRm表面等離子體共振顯微鏡(免標記檢測)

作者 Admin 瀏覽 發布時間 17/03/15


表面等離子體共振顯微鏡-免標記檢測分析儀SPRm 200 系列


表面等離子體共振和光學顯微鏡巧妙地結合為研究細胞膜蛋白相互作用開辟一個嶄新的前沿

 活細胞上免標記生物分子結合過程的檢測

 實時結合力及動力學定量測量像圖

光學和表面等離子體共振同時成像

 藥物分子對多細胞或單細胞作用的檢測

 納米尺度上分子結合過程的跟蹤檢測


SPRm200是世界上首臺將表面等離子體共振技術和光學顯微鏡巧妙結合為一的生物傳感檢測儀。它為免標記研究分子相互作用的領域開辟一個嶄新的前沿。專門針對細胞膜蛋白和相關分子免標記檢測而設計的SPRm200儀器可幫助您在實時觀察細胞結構的同時能夠測量藥物和靶點在細胞上的結合過程,并且可以在其自然狀態下完成對藥物和膜蛋白之間相互作用的測量。應而不在需要從細胞中提取和分離膜蛋白。依靠它出色的靈敏度和穩定性,SPRm200也能夠測量納米尺度的結合行為,可用于研究細菌或病毒與抗菌性藥物的相互作用,以及發展納米級顆粒藥物遞送的新方法。

集成光學顯微鏡與SPR技術


SPRm200把SPR技術和光學成像結合起來,能夠把活細胞成像和對藥物分子結合反應定位分布圖像實時地表征出來。如圖1所示,明視場聚光燈將生長于芯片表面的細胞照亮,在底部的照相機捕獲活細胞的明視場。同時SPR光源沿共振角度投射光線到傳感器芯片上,由SPRm200探測器捕捉反射光,并把在每一個像素點上的SPR響應信號記錄下來構成SPR像圖。

相比傳統的SPR技術只能在整體傳感區域內(通常稱之為通道)測量平均共振角度的變化,SPRm200探測器能夠測量局部像素點上的共振角度變化并且記錄每一個像素點上的傳感曲線圖。如圖2 就顯示了SPRm200同時記錄的明視場圖和SPR像圖以及圖中任何一點或區域的傳感曲線圖。因此它能提供更多的局部信息,并且可以在自然狀態下研究膜蛋白的非均相表面結合以及它們和藥物之間的相互作用。


凝集素- 糖蛋白相互作用



基本的細胞和治療過程通常開始于配體與膜蛋白的結合,并且膜蛋白在其天然狀態中的結合活性研究對于理解它們的生物學功能至關重要。這里是研究糖蛋白(膜蛋白)和凝集素(配體)之間的特異性相互作用以及單個細胞膜上的受體的結合活性和空間分布的實例。

將神經瘤細胞SHEP1在芯片上的細胞室中被孵化,然后置于SPRM樣品臺上。將PBS緩沖液在25℃以300ul/min的流速加入細胞室。將凝集素,80ug/ml的小麥胚芽凝集素(WGA),注入細胞室,然后用PBS緩沖液沖洗。用不同的WGA濃度(5, 10, 40, 80, 100, 200ug/ml)重復對細胞的類似測量。使用50mM GlcNAc 溶液來再生細胞表面上的膜糖蛋白受體。

如下圖2所示在每個像素處記錄傳感曲線圖,通過平均細胞圖像內的像素點,可以使用一級結合動力學理論(參見下文)導出每個細胞的結合動力學參數。這里的測量結果與以前發表的數據一致[4]。

繪制nACHRs的結合行為

nAChR膜受體在神經傳遞和尼古丁成癮中起關鍵作用。確定它們在細胞中分布的常規方法基于熒光標記的二次抗體,其不提供直接的動力學并且易于發生假陽性。SPRm200直接測量第一抗體與不含第二抗體的nAChR的結合。該過程更加簡單,克服了使用被標記的第二級抗體所帶來的缺陷。


上圖中,SH-EP1工程化細胞在細胞膜上表達α4β2受體,并結合初代抗體抗α4(右圖)。通過SPR 像圖所顯示的nAChR 同其初代抗體結合的分布(粉紅色),可以明顯看出這是一個非均相的表面結合。用SH-EP1野生型細胞來作為對照, 傳感曲線右下圖A顯示了兩種類型的細胞對nAChR的反應具有顯著差異。如傳感圖B中所示,從SH-EP1工程化細胞反應減去野生型細胞反應(主要出于體積折射率效應)給出nAChR與其第一抗體的結合動力學,kon =6×104/Ms,koff = 3×10-3/s 和KD=45nM。

納米顆粒檢測


在納米尺度上,由一個納米顆粒所產生的SPR響應信號非常獨特。就好像把一個小石子放在一個緩緩流動的淺溪中,水面上就會產生一個波紋圖案(參考下圖)。SPR光源按共振角度投射到傳感器芯片上使其產生一個沿著金屬膜表面傳播的表面等離子體(SP)波,如圖3所示。當一個納米顆粒結合到芯片表面時,它便成為SP波的散射點,因而會在SPR像中產生波紋圖案。其形狀遠遠大于納米顆粒的實際尺寸(100 倍以上)。這放大的波紋圖案使得SPRm200能夠檢測到粒子尺度遠小于其光學衍射的極限,通過對這個放大的波紋圖案進行跟蹤和測量,就能實現對分子在納米尺度下的結合行為進行監測和研究。

 


在SPR像中,這些波紋的產生以及其強度的變化為納米顆粒和芯片表面或和溶液中其它分子的相互作用提供了非常豐富的信息[1,5]。

細菌和抗生素

活的大腸桿菌O157:H7 在LB肉湯培養基中通過抗體偶聯被系在傳感器芯片上。他們因散射芯片中的SP波而在SPR像上產生許多點波紋如下圖右邊所示。

     

雖然明視場的細菌細胞像(小黑點)穩定,SPR像中的點波紋強度有著顯著的變化。通過監測這些波紋在納米尺度下的強度波動,可為我們提供細菌細胞的新陳代謝的重要信息。當將500μg/mL的殺菌性抗生素多粘菌素B(PMB)加入細胞室時,細菌細胞的波動急劇減弱(下右圖),從而表征細菌的死亡。 
  這個實驗表明了SPRm200能對抗生素活動的實時無標記的檢測,并且提供了一個快速,簡單,和低成本的臨床微生物學檢測方法[1].

系統規格表


系統規格表

基礎配置

光源

690 nm

入射角

40-76 Deg (連續)

基線噪聲

< 0.6 RU RMS (0.1 mDeg RMS)

基線漂移

3 RU/hr (0.5 mDeg/hr)  (當周圍環境漂移< 1°C/hr)

溫度控制范圍

15°C to 40°C (降溫限止在低于室溫10°C)

視場

Bright Field:  1200 x 900 um SPR:  600 x 450 um

放大倍數

Bright Field:  x10 SPR:  x20

分辨率

Bright Field & SPR:  1 μm

平臺的平移和旋轉(范圍)

3mm x 3mm / 360 deg

外形尺寸

690 (w) x 330 (h) x 340 (d) mm

重量

23 kg

電源

110-230 V 50/60 Hz

流體處理

樣品體積

1 to 1500 μL (application dependent)

動力學常量

a  <1 X 107   M-1 s-1

d   >1 X 10-5   s-1

離解常量

KD   = 10-3   M (1 mM) to 10-12    M (1 pM)

分子量篩截

200 Da

控制體系

電腦

微軟Windows操作系統

軟件

ImageSPRTM   軟件,包括數據分析和動力學分析包

自動進樣器

(可選)

試樣容量

2 x SBS standards  (384/96)

2 x 48 Vials  (1.5ml)

2 x 12 Vials  (10ml)

注射體積

0ml  to  9999ml

樣品冷卻

Minimum:   4+/-2

外圍尺寸

300(W) x 575 (h) x 360 (d) mm

凈重

21kg




傳感器和耗材

金傳感器晶片

高均一性金膜芯片確保SPR測量的一致性                                       

細胞室裝備

硅膠池固定在金膜芯片上用于細胞培養;包括用于處理傳感器表面的化學藥品以及配件。


參考文獻

 K Syal, R Iriya, Y Yang, H Yu, S Wang, S Haydel, HY Chen, NJ Tao, "Antimicrobial Susceptibility Test with Plasmonic Imaging and Tracking of Single Bacterial Motions on Nanometer Scale", ACS Nano, 10, 845-852, 2016
 F Zhang, S Wang, L Yin, Y Yang, Y Guan, W Wang, H Xu, NJ Tao, “Quantification of Epidermal Growth Factor Receptor Expression Level and Binding Kinetics on Cell Surfaces by Surface Plasmon Resonance Imaging", Analytical Chemistry, 87(19), 9960-9965, 2015
 W Wang, L Yin, L G-M, S Wang, X Yu, S Eaton, S Zhang, H Chen, J LaBaer, NJ Tao, “In situ drug-receptor binding kinetics in single cells: a quantitative label- free study of anti-tumor drug resistance”, Scientific reports, 4, 1-7, 2014
W Wang, Y Yang, S Wang, V Nagaraj, Q Liu, J Wu and NJ Tao, "Label-free measuring and mapping of binding kinetics of membrane proteins in single living cells", Nature Chemistry, 4, 846-853, 2012
Wang, Shaopeng, et al. "Label-free imaging, detection, and mass measurement of single viruses by surface plasmon resonance." Proceedings of the National Academy of Sciences 107.37 (2010): 16028-16032.


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